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液相色谱柱的使用误区

点击次数:167 发布时间:2021-09-16

                                                                   液相色谱柱的使用误区

                                                              上海连桥生物科技有限公司

         误区:空气会彻底毁灭一根HPLC色谱柱 

当色谱柱不与色谱仪连接的时候,用户需确保色谱柱被紧紧地密封。事实上,实际的应用中是,即使柱的端部进入了少量的空气也不要紧。因为当你将色谱柱连接到色谱仪上使用时,在系统初始加压阶段,在很短的时间内空气就会被溶剂冲刷掉。所以,不要因为色谱柱进入了空气而认定色谱柱已被损坏。 

误区:保护柱是没必要的

使用保护柱有很多好处。首先,保护柱可以防止化学物质或颗粒物损坏分析柱。其次,相较之更换一根昂贵的分析柱,更换一根5mm的保护柱只需要很少的花费。现代的保护柱具有几乎无死体积、更换快速,以及适用于UHPLC的高压等优点。   

        误区:所有的C18(L1)色谱柱都是一样的

美国药典委员会(USP)开发了一种分类系统,用来对每种类型的键合相柱进行分类。由于C18色谱柱是一种广泛应用的色谱柱,故该系统将其称为“L1"。可惜不幸的是,大约有800种以上的L1流入了市场,因此,事实证明这个系统是不可靠的,是一个令人困惑的系统。  因为每种商品化的C18色谱柱,虽然同样是选用硅胶作为基体,但各自都有自己特定的填料键合合成工艺,因此色谱性能也不相同。譬如,有的生产厂商采用十八烷基一氯硅烷键合试剂和低表面积的硅胶,而其它一些厂家采用同一硅烷试剂但选用了表面积更高的硅胶基体。这两种C18柱表现的色谱性能不同,后者C18固定相的键合比例大于前者。较低的固定相键合比率,表面未反应的硅醇基较多,有时混合保留机理起主要作用。  

某些色谱柱生产商使用二氯硅烷和三氯硅烷作键合试剂,将键合相聚合反应形成一很厚的具有不同扩散特性的疏水层。为使键合后硅胶表面未反应的硅醇基比例降低,有些生产商用小分子的硅烷试剂(如基氯硅烷)封尾。  

硅醇基是在中性条件下测定碱性物质时导致色谱峰拖尾的原因之一,有些生产厂家,更进一步的做法是采用第二种小分子硅烷进行双封尾工艺,以提供一个更加惰性(疏水性)的硅胶表面。  

另外有些生产商采用聚合物基体材料进行C18键合,生产出一种完全不同的C18填料,但仍然被归类到“L1"。还有厂家采用反应性能不同的硅烷化试剂,制造出一种与氯硅烷反应产生的不同的C18固定相。  

       误区:反相色谱柱不可以使用纯水相 

这个误解其实是起源于有些用户在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时,发生了俗称相塌陷的现象,所以大家就认为反相色谱柱不可以使用纯水相。  

许多色谱工作者都被相塌陷现象和保留时间位移现象困扰着,甚至已经失去了努力寻找解决途径的耐心。因此,他们索性就认为不应该在反相色谱柱中运行水含量很高的流动相。

然而,事实上市售的反相色谱柱(如极性嵌入和极性封端柱)都是具有水浸润性的,其表面特性是允许使用纯水的,而不会导致塌陷或者保留时间移位。 比如科思美析COSMOSIL的C18-PAQ系列则可以使用100%水作为流动相,适合分离亲水型化合物,并相较于传统的十八烷基键合硅胶色谱柱,具有很强的抗酸性。  

误区:不可以将HPLC色谱柱反接以便于冲洗掉其中的颗粒物 

实际上HPLC色谱柱的填装压力比最大使用压力高很多(通常会高2倍)。如果装柱时使用了恰当的匀浆剂,并且分配一定的时间使柱床稳定,一支填装良好的色谱柱是完全可以双向使用的。  

液相色谱柱上基本都有→标志,表示流动相的流动方向,有的在色谱柱上印有“Nerver Lot Flow in the Opposite Direction"字样,翻译成“决不能反冲"的意思,色谱柱可以反冲吗、色谱柱能不能反冲的问题争议很大,但在我们工作中,用色谱柱反冲技术修复色谱柱可以收到柱效提高、柱效恢复的效果。

一、分析氨基酸的离子交换柱,使用一段时间反柱效明显下降,用NaOH活化,达不到要求,但用NaOH反冲活化可迅速恢复柱效。  

二、色谱柱使用一段时间后柱效下降,此时可拆下柱入口端螺帽,去掉1-2mm被污染填料,再用相同填料填满,然后用流动相反冲一下,可使柱效恢复,因反冲可以改善柱头死空间。  

三、因反冲可把沉积在过渡板上的细微颗粒冲走,有时也可用反冲技术使柱压降低。  

反向使用色谱柱有一个例外,就是生产商在色谱柱的进样端使用了孔径更大筛板的情况,反向使用可能会将填料从柱床冲出。如果制造商在柱的入口处使用的是高孔隙率的玻璃料,那么将柱反冲的话,可能会将柱填料从填充床上冲洗掉。  

色谱柱在工厂填装时,出口端的筛板孔径必须比色谱柱中最小颗粒的粒径还要小。譬如,色谱填料平均粒径是5μm,粒径分布范围是3-7μm,出口端筛板孔径必须小于3μm,使填料没有可能从柱床跑到色谱柱筛板外面。  

大多数生产厂家选择的筛板孔径是2μm。至于某些厂家两端的柱筛板孔径不一样,一般是进样端大些,出样端小些。因此,一些制造商会在柱子标签处放置一个箭头指示,表明必须仅在一个方向上使用。可以肯定有这种可能性,所以一个色谱工作者应该好好阅读色谱柱手册或说明书,或与制造商确定这根色谱柱是否可以反冲。  

误区:色谱柱填料粒径越小、压力越高,分离效果越好 

超小的粒径以及超高的柱压,并不一定是色谱工作者的最佳选择!现代色谱柱的柱特性研究已经引发出一些新方法来评估一根色谱柱的性能。例如,采用新的表面多孔材料的色谱柱,其柱效与sub-2μmUHPLC柱效一样好,然而与常规的LC填料色谱柱比起来,柱压很低。  

                                                                                                                                本篇转载至实验之家

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