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菲罗门液相色谱柱使用后的清洗与保存

点击次数:123 发布时间:2022-04-21
 
  菲罗门液相色谱柱使用一段时间后,总会有一些杂质累积在柱内,保留值较弱的物质,一般能快速从色谱柱冲洗出来,不产生干扰;中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来,但对分析产生一定的干扰;强保留杂质通常聚集在柱头或色谱柱中,难以被洗脱,甚至可能与填料发生相互作用,形成新的伪固定相,改变色谱柱的分离性能。通常表现为柱压升高、基线不平、色谱双峰、分离性能降低等。这些被污染的色谱柱经清洗后,可恢复部分甚至大部分离能力。因此使用后认真、定期清洗,不仅能延长色谱柱的使用寿命,节省资源,还能大大降低分析的成本。以我们常用的硅胶基质色谱柱为例,简要阐述常用色谱柱的清洗与再生。
 
  1、菲罗门液相色谱柱的清洗与再生
 
  色谱柱的使用前后都需经较强的流动相冲洗。通常情况下,在使用硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱时,每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶剂低流速长时间的冲洗;键合反相硅胶色谱柱、离子交换色谱柱和凝胶色谱柱可先用高比例的水(甲醇水混合溶剂)冲洗,再用100%甲醇冲洗。此外,色谱柱低流速的反相冲洗能够有效除去堵塞在柱头或筛板上的杂质,以及清洗聚集在柱头部位的较强吸附物质。有些色谱柱在许多方法处理污染失效后,反过来使用,不仅柱压降变小,柱效也可恢复如,延长了色谱柱的使用时间。
 
  若上述常规清洗法无法清除污染物,则有必要采用更强的洗脱剂清洗,如反相材料的冲洗顺序为:100%甲醇→100%乙腈→乙腈∶异丙醇(75∶25,V/V)→100%异丙醇。或者可以采用较低浓度的稀酸或稀碱可将有机溶剂不能洗脱的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱,可取得良好效果;或者采用1%氢氧化铵或50%二甲基甲酰胺水溶液,对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果。
 
  如果分析时流动相中含有缓冲液(通常为盐溶液),冲洗时宜用水取代缓冲液与有机相混合冲洗色谱柱(20倍柱体积);再用100%有机溶剂冲洗。若直接用100%有机溶剂冲洗,可造成缓冲液沉积析出,从而损坏柱子品质。同样的,若流动相中加入酸、碱溶液时,也应当按照上述方法,先采用高比例的水(水:甲醇10:90)冲洗20倍柱体积,防止强酸强碱溶液导致硅胶基质填料的溶解。
 
  蛋白质对反相色谱柱的污染已成为常见问题,尤其在分离未经处理的动物组织等生物样品。一般情况下,纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色谱柱,因而需要一些特殊的清洗方法。首先尝试用高比例强极性溶剂的流动相进行冲洗,如乙腈∶异丙醇(1:2,V/V);或使用0.1%的三水溶液或者0.1%乙酸水溶液清洗。此外,还可以采用1%十二烷基硫酸钠(SDS),然后用5%~95%乙腈/水(含0.1%TFA)梯度冲洗,去除蛋白污染物效果也较好。
 
  若采用上述的条件清洗后色谱柱仍不能达到理想的效果,有必要将固定相从色谱柱内取出,进行清洗再生后重新装填。具体操作是:将色谱固定相从色谱柱内打出后,用甲醇浮选,去除其中细小的破碎颗粒;然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗;最后干燥固定相,重新装填色谱柱。经该方法处理的色谱柱,性能可得到显著提高。
 
  2、色谱柱的保存
 
  色谱柱的保存应按照使用说明书中所指明的溶剂进行填充,尽可能的贮存于100%有机溶剂。色谱柱不能贮存在水或含水量高的溶剂中,会引起微生物的滋生,影响色谱柱寿命。如反相色谱柱长期不用,最好采用90%~95%的有机溶剂混合水溶液保存,防止色谱柱因密封不严造成色谱柱两头干涸、断层引起的寿命缩短。
 
  此外,色谱柱还应当轻拿轻放,避免剧烈碰撞引起的色谱柱填料产生塌陷、断层,缩短使用寿命。
 
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