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避免RNA降解的注意事项

点击次数:605 发布时间:2022-09-16

上海连桥生物科技有限公司

避免RNA降解的注意事项

1. 使用正确的细胞或组织储存条件 

在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80°C,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致 RNA 的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。RNAfixer 使样品储存更为便利。储存在 RNAfixer 中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达 1 个星期,在 4°C 可稳定保存长达1 个月,或**保存在-20°C。 

2. 消除环境 RNase 的污染 

为了得到完整的、高品质 RNA,在整个 RNA 制备过程中,当 RNA 离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的 RNase 污染就非常关键。由于 RNase 几乎是**,所以必须确保与纯化的 RNA 接触的每一样东西都是无 RNase 污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如 RNase 喷雾清除剂来处理过,去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的 RNase 污染,可以用 RNAsafe。必须保证一直使用无 RNase 的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。 

3. 迅速灭活内源的 RNA 酶,以防止 RNA 降解 

以下 3 个方法均可有效使内源 RNA 酶失活: 

1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。 

2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间

就能冻结,以确保瞬间令 RNA 酶失活。 

3)立即将样品置于 RNAfixer 无液氮 RNA 样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂,

能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的 RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄(<0.5 cm),这样 RNAfixer 才能在 RNase 破坏 RNA 之前迅速渗入组织块中。                                               

4.选择合适破壁方法 

细胞或组织的*匀浆对 RNA 提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止 RNA 的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常需要更加剧烈的方法,通常用液氮研磨。比如说细菌(特别是革兰氏阳性菌)的细胞壁,就需要溶菌酶消化来实现*的细胞裂解和 RNA 的最大回收,酵母提取时加入破壁酶帮助破壁。 

5.选择最适 RNA 提取试剂(盒) 

现有众多的 RNA 分离方法也许令人难以取舍。目前**也是**的方法是柱式分离,也就是结合基于 Trizol 原理的裂解液和硅胶膜吸附柱的使用,是目前比较通用的一种方法。

对于动物细胞,组织,植物叶片等常用材料都基本适用。植物 RNA 的提取比较难抉择,像根和果实等,由于多糖,多酚物质的存在,很难纯化;还有就是血清等液体样本的提取,水分多或者 RNA 含量少等,较难提取。可以采用针对性的试剂(盒) 

6. 低浓度 RNA 的沉淀 

纯化得到的 RNA 可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀(加 0.1 体积的 5M  醋酸铵、2-2.5 体积的无水乙醇,-20°C 放置 25 分钟以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如  linear acrylamide 糖原 glycogen,酵母 yeast  RNA)的方法。核酸助沉剂是 linear  acrylamide,当RNA 用于 RT-PCR 分析时,线性的丙烯酰胺和 DNase 处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂,因为它们都不含 DNA 污染,糖原含量高会抑制 PCR 反应,应注意控制浓度,核酸助沉剂对 PCR 无影响,成为病毒核酸提取的**。酵母 RNA 和未处理的糖原会给样品带来核酸污染,有可能影响 RT-PCR 的结果。沉淀后,注意避免 RNA 沉淀过分干燥,因为这可能导致很难重新溶解。 

7.提取好的 RNA 如何储存 

RNA 最好是提取完成后,立刻进行下游实验。如果只是短期储存,重悬的 RNA 应放置于-20°C;如果是长期储存的话,就应该放置于-80°C。储存 RNA 时,可以加入少量的 RNA酶抑制剂防止 RNA 的降解。 


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